发布日期：2025-07-03 15:23 点击次数：124
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序言Hello小伙伴们环球好，我是生信手段树的小学徒”我才不吃蛋黄“。今天是胃癌单细胞数据集GSE163558复现系列第十一期。第十期咱们使用通过CopyKAT分析想象CNV评估上皮细胞良恶性。本期，咱们将对T细胞亚群进行细分。
1.配景先容德国玄学家莱布尼茨说过:“世上莫得两片系数交流的树叶。”物种是有其千般性的。对于细胞来说雷同如斯。从表面上讲，咱们不错对细胞亚群进行无尽分群。在初度分群时，不错不休改换区别率，雷同在细胞持重之后，咱们也不错进行亚群再细分。其实分群亦然锻真金不怕火咱们对分群“度”的把控以及生物学配景学问的储备。细胞持重前咱们要确保分群数目鼓胀多，而这个数目不绝是要卓越该组织表面的细胞类型数目。在进行亚群细分时，愈加需要雄壮的生物学配景学问储备以及对区别率和再分群次数的“度”的精确把抓。细胞亚群的分群的依据包括：1.细胞异质性（每个细胞皆有特有的抒发模式和功能，皆有我方特有的基因）；2.细胞共性（合并类型的细胞皆有类似的抒发模式）；3.生物学基础学问（基于已有的学问，对细胞进行分类果决）。
T淋巴细胞（T lymphocyte）简称T细胞，是由开始于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺均分化、发育练习后，通过淋巴和血液轮回而漫步到全身的免疫器官和组织中阐明免疫功能 。T细胞分类范例有多种：按细胞名义分化抗原 (CD)的不同，可分为CD4+和CD8+两大亚群;按T细胞名义受体 (TCR)的不同，可分为αβT细胞γδT细胞;按功能可分为接济性T细胞 (Th 细胞)、禁止性T细胞 (Ts细胞)、细胞毒T细胞 (CTL或Tc细胞)和迟发型超敏反馈T细胞 (TDTH细胞);按抵拒原应付的不同，分为启动T细胞 (naive T cell)、活化的T细胞 (activated T cell)和操心性T细胞 (memory T cell);以及区别于传统T细胞的NKT细胞等等。在第一次分群持重中，咱们只持重到了“启动的”T细胞。在这里，咱们对T细胞亚群进行了粗“细分”。
2.数据分析2.1 导入数据当先索要第三期亚群持重后的T细胞数据：
rm(list=ls())options(stringsAsFactors = F)library(Seurat)library(ggplot2)library(clustree)library(cowplot)library(dplyr)dir.create("9-T")setwd("9-T/") getwd()set.seed(12345)sce.all=readRDS( "../3-Celltype/sce_celltype.rds")table(sce.all$celltype)sce1 = sce.all[， sce.all$celltype %in% c( 'T' )]2.2 降维分群聚类细分亚群的经过很大概，和简短分群一样，等于对亚群的Seurat对象再次走降维分群聚类。
Seurat V5表率经过：
LayerData(sce1， assay = "RNA"， layer = "counts")sce1 <- JoinLayers(sce1)as.data.frame(sce1@assays$RNA$counts[1:10， 1:2])head(sce1@meta.data， 10)table(sce1$orig.ident) sce = sce1sce <- NormalizeData(sce， normalization.method = "LogNormalize"， scale.factor = 1e4)GetAssay(sce，assay = "RNA")sce <- FindVariableFeatures(sce， selection.method = "vst"， nfeatures = 2000) sce <- ScaleData(sce) sce <- RunPCA(object = sce， pc.genes = VariableFeatures(sce))
DimHeatmap(sce， dims = 1:12， cells = 100， balanced = TRUE)
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ElbowPlot(sce)
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登第0.1区别率，对T细胞进行聚类分群（为什么登第0.1，迎接环球在驳斥区或者微信群留言酌量）:
sce <- FindNeighbors(sce， dims = 1:15)sce <- FindClusters(sce， resolution = 0.1)table(sce@meta.data$RNA_snn_res.0.1) set.seed(321)sce <- RunTSNE(object = sce， dims = 1:15， do.fast = TRUE)sce <- RunUMAP(object = sce， dims = 1:5， do.fast = TRUE)mycolors <-c('#E64A35'，'#4DBBD4' ，'#01A187' ，'#3C5588' ，'#F29F80' ， '#8491B6'，'#91D0C1'，'#7F5F48'，'#AF9E85'，'#4F4FFF'，'#CE3D33'， '#739B57'，'#EFE685'，'#446983'，'#BB6239'，'#5DB1DC'，'#7F2268'，'#6BD66B'，'#800202'，'#D8D8CD'，'pink')p = DimPlot(sce，reduction = "tsne"，label=T，cols = mycolors) p图片
2.3 SingleR持重SingleR是一种用于单细胞 RNA 测序 （scRNAseq） 数据的自动持重范例。给定具有已知标签的样本（单细胞或块）的参考数据集，它字据与参考的相似性象征测试数据蚁合的新细胞。
singleR使用面貌：成人影片网站
需要一个数据库文献，构建SingleR进行单细胞亚群定名的参考数据库
使用SingleR包内部的SingleR函数即可把数据库内部的细胞亚群持重信息映射到需要定名的单细胞转录组数据集内部。
告捷的运行了SingleR包内部的SingleR函数之后，就不错拿到每个单细胞的具体的身份信息
确定先容请见公众号前期推文：SingleR及数据库资源包celldex简介 。
SingleR包的装配形式有以下两种：
使用devtools包进行装配：
devtools::install_github('dviraran/SingleR')或者下载土产货装配：
# 装配依赖包install.packages(c("outliers"， "pbmcapply"， "doFuture"))BiocManager::install(c("GSVA"，"singscore"))# 装配SingleR包install.packages("~/SingleR.tar.gz"， repos = NULL， type = "source")celldex包是singleR自动持重需要的数据库，当今还是上传到Bioconductor，装配范例如下：
BiocManager::install("celldex")加载R包：
library(SingleR)library(celldex)library(dplyr)library(stringr)library(pheatmap)library(ReactomeGSA)library(ggplot2)library(singleseqgset)library(devtools)
入手SingleR持重：
getwd()load('/home/data/t020505/GSE163558-GC代码版/9-T/hpca.RData')load('/home/data/t020505/GSE163558-GC代码版/9-T/bpe.RData')unique(hpca.se$label.main)unique(hpca.se$label.fine)unique(bpe.se$label.main)unique(bpe.se$label.fine)#bpe.se <- BlueprintEncodeData()#save(bpe.se，file = 'bpe.RData') str(sce)anno <- SingleR(sce@assays$RNA$data， ref = list(BP=bpe.se，HPCA=hpca.se)， labels = list(bpe.se$label.fine，hpca.se$label.main)， clusters = sce@meta.data$seurat_clusters)plotScoreHeatmap(anno，clusters = anno@rownames，show_colnames = T)table(anno$labels)图片
使用DimPlot可视化亚群细分之后的情况:
celltype = data.frame(ClusterID=rownames(anno)， celltype=anno$labels， stringsAsFactors = F) sce@meta.data$singleR = celltype[match(sce@meta.data$seurat_clusters，celltype$ClusterID)，'celltype']table(sce$singleR)p1 = DimPlot(sce， reduction = "tsne"， group.by = "singleR"，label = T，cols = mycolors，label.box=T) p1
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p1图片
p+p1咱们不错发现，Treg由3群和4群构成，昭彰还不错细分。此外，由于这里是从T细胞中持重到了一个B细胞（6群），不错望望象征基因抒发情况：
Idents(sce) = sce$singleRVlnPlot(sce， features = c("CD3D"，"CD3E"，"CD4"，"CD8A"，'MS4A1'，'IGHG1'，'MZB1'， 'CD79A')， pt.size = 0， ncol = 4， cols=mycolors)小提琴图恶果线路，这一群还果真B细胞啊，东说念主工持重照旧得匹配考据：
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那么问题来了，T细胞群中为什么会混入B细胞？迎接环球留言或者加入单细胞周更读者群张开酌量。
结语本期，咱们使用singleR对T细胞亚群进行细分。下一期，咱们将对进行高瓜分析“细胞通信”。趁机提前预报一下，胃癌系列推文完成后，将开启肺腺癌单细胞数据集GSE189357复现系列，相关视频还是在B站上线
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文献推文详见（单细胞测序+空间转录组态状从癌前病变到浸润性肺腺癌的动态演变）。此外，对于推文实质的擢升和优化，迎接环球提可贵主张。谢谢！
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